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本项研究受到国家重点基础研究发展计划(973)

发布时间:2018-07-26

近日,清华大学环境学院王书肖团队合作建立中国汞流向并揭示汞排放全球驱动力,生命学院李雪明研究组合作发文揭示细菌II型分泌系统外膜复合物的分泌机制,医学院董忠军课题组

  近日,清华大学环境学院王书肖团队合作建立中国汞流向并揭示汞排放全球驱动力,生命学院李雪明研究组合作发文揭示细菌II型分泌系统外膜复合物的分泌机制,医学院董忠军课题组报道一种人类免疫缺陷病的致病机制,医学院刘晓冬研究组发文揭示抑制钙离子通道的新方式,环境学院合作发文揭示重霾期间硫酸盐生成机制,生命学院王新泉、向烨研究组发文揭示冠状病毒入侵宿主细胞关键步骤。

  全球汞污染问题已经引起国际社会的广泛关注。2016年8月31日,我国政府正式向联合国交存了《关于汞的水俣公约》的批准文书,成为第三十个批约国。按照公约要求,各缔约国应在汞的供应来源和贸易、添汞产品、使用汞或汞化合物的生产工艺、大气汞的排放、水体和土地汞释放、以及汞废物处理处置等多个领域开展污染控制。然而,中国相关领域的研究目前主要集中在大气汞排放,对公约其他条款涉及的汞供应与使用、水体和土地汞释放等缺乏研究。此外,已有研究往往对不同源进行孤立分析,而忽略了源之间由于废物和副产品流动和使用导致的排放和释放,同时缺乏对水体和土地汞释放的全球驱动力研究。

  本研究采用物质流分析的方法和多区域投入产出模型进行综合研究。结果表明,中国2010年汞输入量达到2643吨。其中,原生汞矿开采的汞输入量为926吨;由于使用燃煤、有色金属精矿等原料输入的汞量为1714吨;其余来自生物质燃烧。输入的汞主要排放到大气(633 吨)、释放到水体(84 吨)、释放到土地(651 吨)、暂存在固体废物和产品(795 吨)、固化稳定化(420 吨)、随产品出口到其他国家(129 吨)。不同生产活动间的废物和副产品的流动和使用能够减少汞向土地的释放量,但是由此带来102吨大气汞的二次排放。

  这些研究结果表明,未来汞污染控制应从物质流的角度建立综合控制策略,从而减少汞的跨介质和跨部门污染,而不仅仅是针对单一环境介质或某一行业开展减排控制。此外,研究发现中国67%的汞排放/释放主要受本国消费的驱动,剩余排放主要受美国、日本等其他区域消费的驱动。其中,美国是中国汞排放/释放的最大外部驱动力。这些研究成果将为中国汞污染控制和履行汞公约提供基础数据支撑,也将为汞公约的进一步完善和未来缔约国的责任分配提供重要科学依据。

  清华大学环境学院硕士生惠霂霖(2016年7月毕业)、博士后研究员吴清茹为本文共同第一作者,王书肖教授与美国密歇根大学梁赛博士为共同通讯作者。本项研究受到国家重点基础研究发展计划(973)项目、国家自然科学基金、中国博士后基金、中国国家哲学社会科学基金重大项目、区域环境质量协同创新中心等部门的支持。

  1月9日,清华大学生命科学学院李雪明课题组在《自然结构和分子生物学》(Nature Structural & Molecular Biology)杂志在线发表题为《细菌II型分泌系统的分泌素结构及其工作机制》(Structural Insights into Secretin Translocation Channel in Type II Secretion System)的研究论文,该工作通过冷冻电镜的研究手段首次揭示了细菌II型分泌系统外膜复合物GspD分泌素通道的原子分辨率结构以及通道的半开放状态结构,结合相应的生化实验,阐述了底物通过II型分泌系统分泌素的分泌机理。

  革兰氏阴性菌通过一系列不同类型的分泌系统向胞外或者其他细胞分泌各种底物,包括离子,小分子(如抗生素),大分子物质(如毒性蛋白,脱氧核糖核酸)等,这些分泌出的底物大多都与人类健康息息相关。其中的II型分泌系统(T2SS)分泌的底物主要是折叠好的成熟蛋白质,通常是与疾病直接相关的毒性因子或效应蛋白,其中比较熟知的有霍乱毒素、肠毒素,以及外毒素A。T2SS的外膜复合物分泌素GspD是分泌底物通过细菌外膜的最后通道,先前只有N末端几个结构域的晶体结构,以及低分辨冷冻电镜结构。长久以来,缺乏高分辨率的结构信息来帮助理解通道的整体构造及相应的底物分泌机理。

  该工作通过冷冻电镜单颗粒重构的方法首次解析了全长分泌素GspD复合物约3埃分辨率的分子结构,包括大肠杆菌(Escherichia coli)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)来源的两种复合物。这不仅是T2SS外膜复合物第一个全长的原子分辨率结构,也是分泌素家族的第一个全长的原子分辨率结构。该工作首次揭示了GspD复合物具有十五重对称性(C15),不同于之前报道的十二重对称(C12)结构模型。该分子结构清晰地展示了蛋白N端结构域形成的环形通道结构,澄清了之前通过晶体结构推测出来的不准确结构模型。该工作还首次观察到了一个由C端结构域形成的新颖的双层β桶构造,其中每层至少有60根反平行的β股(β-strand)构成,是目前结构已知的最大β桶构造的通道。这一巨大的桶形结构由外表面上结合的S结构手把手围绕起来,发挥稳定双层β桶的作用。通过在中心通道的边缘区域点突变的方法将非常保守的甘氨酸突变成丙氨酸,使关闭的分泌素通道转变成到一个半开放的状态,通过进一步的结构和功能分析,本工作阐述了底物通过分泌素GspD通道的分泌机理。

  图为分泌素GspD蛋白的冷冻电镜结构和通道开关的分子机制。(a)GspD复合物的电子密度图和原子模型图。上半部分为大肠杆菌(Escherichia coli)来源的GspD,下半部分为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)来源的GspD,右半部分为电子密度图和原子模型叠加在一起的顶视图。(b)半开放状态的结构与野生型的对比剖面图。电子密度图低通滤波到7埃。(c)基于得到的结构和生化验证提出的通道开放分子模型图。黑色圆圈表示中间门控起转折的关键甘氨酸。

  清华大学生命学院李雪明研究员和浙江大学的朱永群教授为本工作的共同通讯作者。清华大学生命学院2014级直博生严照峰和北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养博士研究生项目(PTN项目)2014级博士生尹孟为本文共同第一作者。浙江大学博士生徐丹丹也参与了这项研究工作。该工作的冷冻电镜数据采集在国家蛋白质科学设施(北京)的清华大学冷冻电镜平台完成,数据处理在国家蛋白质科学设施(北京)清华大学高性能计算平台完成。该工作获得了生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心、国家自然科学基金委面上项目和科技部重点研发计划的经费支持。

  淋巴细胞活化信号分子结合蛋白 (SAP)依赖和非依赖淋巴细胞活化信号分子 (SLAM)家族受体信号的免疫调节作用。

  淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体具有传递淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)依赖和非依赖信号的能力,淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体传递淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)依赖信号对自然杀伤T细胞(NKT)细胞发育至关重要,淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体或者淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)缺失均导致自然杀伤T细胞(NKT)细胞发育受阻(左);淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)依赖的淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体信号对辅助性滤泡T(TFH)细胞发育可有可无,但对于X连锁淋巴组织增生综合征(XLP)病人,淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体转变成抑制性受体,导致辅助性滤泡T(TFH)细胞发育受损,体液免疫缺陷(右)。

  淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)基因突变导致人类X连锁淋巴组织增生综合征(XLP),表现为多种严重免疫缺陷,如自然杀伤细胞(NK)功能低下、自然杀伤T细胞(NKT)发育受损和无丙种球蛋白血症等。董忠军课题组长期致力于X连锁淋巴组织增生综合征免疫缺陷机理研究,曾发现淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)缺失的自然杀伤细胞偏向性不能杀伤血液细胞《自然免疫学》(Nature Immunology,2009),发现淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)调节自然杀伤细胞活化的双重机制《免疫》(Immunity,2012)。通过制备淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体家族全敲除小鼠,该课题组去年曾发现淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体缺陷导致自然杀伤细胞功能增强,并首次证明淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体作为自身特异性活化型受体参与自然杀伤细胞NK细胞功能获得 (Immunity, 2016)。

  鉴于淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体冗余性以及偶联蛋白家族蛋白的功能复杂性,偶联蛋白缺陷引起的自然杀伤T细胞(NKT)发育和辅助性滤泡T(TFH)细胞分化缺陷的分子机制仍然不清。最新研究显示SLAM家族受体缺陷导致自然杀伤T细胞(NKT)发育严重受阻,而辅助性滤泡T(TFH)细胞分化正常,但是淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体缺失可以完全恢复淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)缺失所导致的辅助性滤泡T(TFH)细胞分化阻滞,而对自然杀伤T细胞(NKT)发育的恢复作用甚微。因此,通过独特的动物模型,他们全面解析出淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)依赖和非依赖的淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体信号对自然杀伤T细胞(NKT)发育和体液免疫的调控机制:淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)依赖的淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体活化信号在自然杀伤T细胞(NKT)阳性选择过程中发挥至关重要的作用;淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)不存在时,淋巴细胞活化信号分子(SLAM)家族受体介导淋巴细胞活化信号分子结合蛋白(SAP)非依赖的抑制信号阻止辅助性滤泡T(TFH)的分化(图)。该研究将促进了解X连锁淋巴组织增生综合征病人T细胞缺陷的分子机制,为该疾病的治疗提供理论依据。

  董忠军研究员为该文通讯作者,生命科学联合中心博士生陈莎莎,硕士生蔡晨旭和PTN联合培养项目博士生李泽华为本文的共同第一作者,清华大学免疫学研究所林欣团队参与合作研究。该研究得到国家基金委、科技部和清华大学-北京大学生命联合中心经费支持。

  1月6日,清华大学医学院生物医学工程系刘晓冬研究组在《e生命》(eLife)期刊在线发表了题为“基于碳末端的多域协同急性抑制L型钙通道”(Cooperative and acute inhibition by multiple C-terminal motifs of L-typeCa2+channels)的研究长文(article)。论文工作综合利用电生理、定量(FRET )荧光能量共振转移荧光成像、化学诱发异源多肽聚合、以及计算机模型仿真等手段,首次揭示了一种抑制L型电压门控钙离子通道的新型方式——“碳末端介导抑制”(CMI)。

  该项研究利用组成性及急性诱发的域间聚合,阐明了通道蛋白碳末端的三个关键域之间的协同法则,论证了碳末端介导抑制(CMI)对通道门控和钙内流的抑制作用,分析了碳末端介导抑制(CMI)机制与钙通道核心门控特性的关联。同时,论文基于帕金森症中重要神经元的仿真计算结果,初步探讨了碳末端介导抑制(CMI)潜在的病生理意义。

  清华大学生物医学工程系博士生刘楠、杨亚雄及葛琳为论文的共同第一作者,刘晓冬博士为本文的通讯作者,参与部分工作的作者还包括清华大学博士后刘敏博士以及美国哥伦比亚大学医学院教授亨利·科尔克拉夫特(Henry Colecraft)博士。

  A图为碳末端介导抑制(CMI)三元素间的协同组合法则(左)。在其中任何两元素空间距离足够接近的情况下,第三个元素作为调控多肽通过碳末端介导抑制(CMI)方式抑制L型钙通道。通过瞬时性施加小分子(雷帕霉素)连接两个多肽(PCRD和DCRD)后,高峰值、强钙依赖性失活(CDI)的钙电流(右图中粉色)峰值大幅降低(削减约65%)同时钙依赖性失活基本消除(青色)。首次揭示了碳末端介导抑制(CMI)的重要特征:无论碳末端介导抑制(CMI)效力(potency)如何,终态钙依赖性失活的电流幅值维持不变,确保碳末端介导抑制(CMI)能够削减钙内流并定量决定了其极限效力(maximum potency),同时提示碳末端介导抑制(CMI)机制可能与钙依赖性失活等经典过程类似地参与通道的核心门控。B图SNc(黑质纹状体)神经元模型中,钙依赖性失活能够削弱CaV1.3钙电流和自发节律性振荡,进而缓解帕金森症(PD)中的钙超载(粉色),提示可利用钙依赖性失活开发新型的疾病干预手段。

  细胞需要钙离子维系正常的生命活动而钙失调(如钙超载等)则会导致多种疾病。细胞膜上的电压门控钙离子(如CaV1.3)通道精确调控钙离子内流及其时空动态,对于心脑等器官的生理机能至关重要,也与心律失常及帕金森症等重大疾病密切相关。因此,抑制CaV 1.3等钙通道的机制及方法成为基础研究及应用开发的重要目标。临床上,钙通道抑制剂(也称为拮抗剂)是常用的抗心律失常药;另外,针对阿尔茨海默症的药物迄今尚未攻克,而钙通道拮抗剂是当前研发中的重要先导药物之一。CaV 1.3通道开放后能够被流入的钙离子以负反馈形式迅速削弱(即钙依赖性失活),多项研究证实这一过程由重要钙结合蛋白—钙调素(calmodulin)所介导;同时,通道蛋白的碳末端能够通过与钙调素竞争影响通道功能,成为另一类重要的反馈型调控。然而,对于碳末端调控的基本效应仍存在重大争议:一方面碳末端调控能够抑制钙依赖失活,具有上调钙内流的倾向;另一方面有证据表明碳末端削弱通道的开放能力(即电压依赖性激活),进而抑制钙内流。两种对立效应同时发生,那么碳末端对钙内流的影响究竟是怎样的?这是领域内悬而未决的挑战性问题。

  刘晓冬研究组从碳末端三个关键域的结构-功能分析出发,发现并建立了三元素协同组合法则:任何两元素如果在空间距离上足够“亲密“,三者将最终形成复合体、将钙调素从通道上驱除、进而改变通道门控特性。基于此法则,利用化学小分子诱导多肽间聚合形成 “亲密”组合,迅速抑制了钙电流瞬态峰值,但并不影响其稳态电流水平,二者共同表现为钙依赖失活的强度降低。结合其它证据,揭示出钙内流能够确保被削弱下调,从而澄清了前述的”矛盾效应”,所依据的基本事实是:碳末端抑制的实质是将钙电流峰值向其稳态值水平压低,其极限抑制效力对应于钙依赖失活的最大强度。这一发现同时提示,碳末端抑制与钙依赖失活同为钙通道的负反馈调控,虽然由不同的事件引发:分别为钙离子与钙调素结合或者是多肽与钙调素竞争,但二者的终态共享相同的核心门控模式,即通道的”抑制“态:超低水平的激活但同时基本不再失活。以上原理及机制预期能够推广至“钙依赖易化”以及“碳末端易化“等上调通道功能的“激动剂”效应,而碳末端调控的高精度结构-功能分析等机制细节,以及其病生理作用,均为后续跟进研究的重要方向。本项研究同时也提供了开发钙通道抑制剂的新范式,神经元模型仿真计算的结果预示:碳末端抑制有望成为帕金森症等疾病的新型干预手段。

  刘晓冬实验室致力于“合成电生理学”研究,通过在分子和细胞水平上功能重建重要离子通道及其跨膜信号,研究与通道相关的病生理机制及干预方法。刘晓冬及其课题组在钙离子通道领域的研究重点在于将自反馈调控与干预因子密切相结合,本研究是此方向上继前期工作(《自然》(Nature)2010; 《细胞报导》(Cell Reports)2015; 《通道》(Channels)2016)的最新进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所以及生命科学联合中心(CLS)等方面的支持。

  近年来北京及华北地区灰霾污染频发,影响范围达30余万平方公里,影响人数逾4亿。针对重灰霾时段的已有研究表明,硫酸盐是重污染形成的主要驱动物种。在绝对贡献上,重污染期间硫酸盐在大气细粒子PM2.5中的质量占比可达约20%,是占比最高的单体;在相对趋势上,随着PM2.5 污染程度的上升,硫酸盐是PM2.5 中相对比重上升最快的物种。然而,现有的基于欧美等清洁地区的大气化学理论体系无法解释重霾期间硫酸盐的迅速生成。因此,找到硫酸盐在重灰霾情景下的特有生成路径是解释重霾形成过程的关键所在。

  图1:典型云水情景(左图)与北京重灰霾情景(右图)下硫酸盐不同生成机制的相对重要性对比。蓝色、灰色阴影分别代不同情景下的典型pH值范围。

  本研究综合运用了外场观测、模型模拟及理论计算等手段,结果表明:重霾污染期间硫酸盐的迅速生成主要是由二氧化硫(SO2)和二氧化氮(NO2)这两种气态前体物溶于颗粒物结合水(AW)后,在我国北方地区特有的偏中性环境下迅速反应生成的。颗粒物结合水是指PM2.5 在高相对湿度下潮解所吸附的水分。该结论与硫酸盐生成机制的经典理论有较大不同。

  图2:基于观测数据计算所得的NO2非均相反应机制速率(红色圆点)与基于模型模拟估算的重灰霾期间缺失的硫酸盐生成速率(菱形)对比。

  经典理论认为,与云水中的液相反应相比,颗粒物结合水中的反应可以忽略;且在液相反应路径中,NO2氧化SO2生成硫酸盐这一路径的贡献可以忽略。前一认知主要是基于颗粒物结合水中的液态水含量要远低于云水含量(一般低至千分之一到十万分之一)这一事实;后一认知则是基于对不同反应路径在典型云中环境(典型气态前体物浓度水平、典型云水pH等)下的理论计算得出的。而重霾污染时的情景与经典情景有很大不同(图1)。一方面,由于颗粒物浓度的大幅上升及静稳气象条件下的高相对湿度等,颗粒物结合水含量远高于经典情景;这使得颗粒物结合水中的反应总量大大提升。另一方面,重霾污染期间NO2浓度为经典云水情景下的50倍以上,这直接改变了NO2氧化路径的相对重要性。最后,由于氨、矿物尘等碱性物质在北京及华北地区的大量存在,使得北京的颗粒物结合水的pH远高于美国等地区,呈现出特有的偏中性环境;而NO2氧化机制的反应速率随着pH值的上升有大幅提升。此外,该机制的反应速率可以有效解释基于经典理论的空气质量模型在重霾污染期间的模拟偏差;这也进一步验证了该研究结论的正确性(图2)。

  该研究表明了我国的复合型污染的特殊性(图3)。高SO2主要来自燃煤电厂,高NO2主要来自电厂和机动车等,而起到中和作用的碱性物质氨、矿物尘等则来自工业污染、扬尘等其它来源。这些不同的污染源在我国同时以高强度排放,导致了硫酸盐以特有的化学生成路径迅速生成;这也是重霾污染期间颗粒物浓度迅速增长的主要原因之一。

  清华大学环境学院博士生郑光洁(2016年7月毕业)与马普所的程雅芳教授为本文的共同第一作者,环境学院的贺克斌院士、马普所的程雅芳教授和尤里希·波舍尔(Ulrich Poschl)教授、苏杭教授作为共同通讯作者,清华地学系统科学系的张强教授为重要作者。

  高致病性冠状病毒感染是全球公共卫生的重大威胁。2002-2003年严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)的爆发导致全球8000多人感染,800多人死亡;2012年中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)从中东地区开始流行,已导致1800多人感染,600多人死亡。2015年世界卫生组织列出了8种可能引起严重爆发性流行的危险病原体,SARS冠状病毒和中东呼吸系统综合征冠状病毒名列其中。迄今为止,还没有针对这两种冠状病毒的特异性药物和疫苗。

  冠状病毒刺突蛋白(spike)为同源三聚体,位于病毒囊膜表面,是已知最大的病毒表面蛋白。刺突蛋白在病毒与宿主细胞接触,与宿主细胞受体结合以及病毒-宿主细胞膜融合过程中起着关键作用,同时也是中和抗体结合及疫苗研发的重要靶点。

  本研究通过冷冻电镜单颗粒三维重构的方法解析了SARS冠状病毒刺突蛋白四种构象的结构。其中构象一为三重对称的结构,分辨率达4.3 埃,在此构象下刺突蛋白的三个受体结合区(RBD)都处于“向下”位置,由于空间位阻,SARS冠状病毒细胞受体血管紧张素转化酶2(ACE2)无法结合刺突蛋白,因此该构象为受体结合的非激活状态。其余三种构象刺突蛋白的对称性被破坏,一个受体结合区抬起处于“向上”位置,在该构象下细胞受体能顺利结合抬起的受体结合区而没有空间位阻,因此这三种构象为受体结合的激活状态。受体结合区从“向下”位置到“向上”位置的转换也是中和性抗体与spike的结合所必需,并且可推广到中东呼吸系统综合征冠状病毒等其他类似的冠状病毒,这对理解冠状病毒侵染宿主细胞的分子机制,以及特异性药物和疫苗的开发提供了重要指导。

  王新泉教授和向烨研究员均为北京结构生物学高精尖创新中心及清华大学医学院传染病研究中心成员,长期从事病毒侵染及免疫逃逸相关的结构生物学研究。2013、2014和2015年,王新泉教授和张林琦教授团队在《细胞研究》(Cell Research)、《科学-转化医学》(Science Translational Medicine)和《科学报告》(Scientific Reports)上分别报道了中东呼吸系统综合征冠状病毒表面刺突蛋白的受体结合区受体结合区与人受体二肽基肽酶4(DPP4)复合物的晶体结构,靶向受体结合区的中东呼吸系统综合征冠状病毒人源中和性抗体MERS-4和MERS-27的筛选与鉴定,以及MERS-27发挥中和作用的分子机制。2016年2月,向烨研究员团队与合作者在《科学》(Science)期刊上报道了埃博拉病毒表面糖蛋白GP与高效中和抗体的冷冻电镜结构和中和机制;6月,向烨研究员团队又独立在《自然》(Nature)期刊上报道了噬菌体突破细菌细胞膜的新机制。此次,两研究组共同协作,解析了SARS冠状病毒刺突蛋白的冷冻电镜结构,并捕捉到了病毒侵染过程中关键的中间状态,极大地促进了研究界对病毒侵染机制的理解。

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  清华大学医学院向烨研究组联合培养博士生桂淼和生命学院2014级博士生宋文飞为本论文的共同第一作者,王新泉教授和向烨研究员为本论文的共同通讯作者。

  王新泉教授实验室博士生周海霞,向烨研究员实验室博士生许靖蔚和陈思炼参与了本项工作。该工作的冷冻电镜数据采集在国家蛋白质科学设施(北京)的清华大学冷冻电镜平台完成,数据处理在国家蛋白质科学设施(北京)清华大学高性能计算平台完成。本工作获得国家自然科学基金委、科技部重点研发计划和北京市结构生物学高精尖创新中心等的经费支持。